תקופה זאת היא רבת ניגודים בתולדות העיר. בשש מאות השנים של השלטון הרומאי ידעה לוד ימי פורענות וימי שלווה, ותושביה ידעו ימי שפל וגם פריחה.
התקופה הרומית מתחילה עם השתלטותו של פומפיוס על יהודה בשנת 66 לפנה"ס וביטל את כיבושי החשמונאים. למרות זאת, לוד נשארה בתחום יהודה והקיסר הרומי יוליוס קיסר מינה את הורקנוס השני לשליט העם.
בשנת 48 לפני הספירה הפכה לוד לאחת מתוך אחת עשרה הטופרכיות - ערי המחוז, שנקבעו ע"י השליטים הרומאיים בא"י: ירושלים, גופנה השניה, עקרבתה, תמנה ולוד, אמעוס, אדמיאה פלי עין גדי, הרודיון ויריחו.
בימיו של הורדוס היתה לוד אחת הערים החשובות . דרך לוד העיר עברה דרך חשובה, שקישרה בין ירושלים לבין ערי החוף אשר שיגשגו בתקופתו.
על תיפקודה של לוד כעיר פלך אפשר להסיק ממשפט שנערך העיר כעשרים שנה לפני חורבן בית המקדש. בימיו של קליאדיוס הקיסר (41 - 54 לספירה), כאשר שלט בארץ אגריפס השני, התגלע סכסוך חמור ביו יהודים ובין שומרונים, שישבו בעיר. היהודים והשומרונים נלחמו אלה באלה בגלל התנפלותם של השומרונים על עולי רגל יהודיים, שהיו בדרכם לירושלים.
בתקופת בית הורדוס, הוטל על לוד (כמו על ערים אחרות) מס. פעם אחת, בשנת 43 לספירה, בימי הקיסר קסיוס, לא שילמו בני לוד את המס, ואז נמכרו תושביה ותושבי הערים האחרות שלא שילמו מס (גופנא, אמאוס ותמנה) לעבדים.

כעשרים שנה לפני חורבן הבית השני, הסתכסכו השומרונים והיהודים, וכשעלו היהודים לרגל לירושלים הם הותקפו על ידי השומרונים. הסכסוך גדל והחמיר עד כי פנו הצדדים אל הנציב הרומי שישב בסוריה, בבקשה לדון בעניינם ולהעניש את האשמים. הנציב קורדטוס בא ליהודה ונכנס לדון בסכסוך בלוד. שם צווה להביא לפניו שמונה עשר יהודים, אשר שמע עליהם שהם השתתפו בסכסוך, והתיז את ראשיהם בגרזן. מתוך: וקרט, אורה, 1977, לוד - גיאוגראפיה היסטורית, הוצאת גומא ועיריית לוד - צ'ריקובר.
בתקופה זו סבלו היהודים רבות מידי הנוגש הזר. כך למשל, התנפל על העיר הנציב הרומי בסוריה, בשעה שבניה יצאו ממנה כדי לעלות לרגל לירושלים בחג הסוכות, או שיצאו להלחם באויביהם. עלי פי יוסף בן מתתיהו, הנציב הרומי שרף את העיר והרג חמישים איש - ילדים זקנים ונשים שנשארו בעיר.
במלחמת הרומאים ביהודים, בשנים 66 - 70 לספירה, כבש אספיסיאנוס בראש הצבא הרומי את המחוזות שעמדו בדרך כיבושיו לירושלים, במגמתו לדכא את ההתקוממות ביהודה, אחד המחוזות היה לוד עם עיר הפלך - לוד. על שר הצבא היהודי יוחנן האסי הוטלה האחריות להגנתה של לוד. על פי יוסף בן מתתיהו, פלך לוד: יושבי הערים לוד ויבנה כרתו ברית שלום עם אספסיאנוס, שהציב בעיר חיל מצב והקים בעיר מחנה גדול לצבאו. על כך כתה יוסף בן מתתיהו: "אחר הכניעו כל מחוז תמנה פנה אל לוד ואל יבנה אשר כרתו איתו ברית שלום והושיב בהן את היהודים אשר נכנעו לפניו ומצאו חן בעיניו" (מתוך: מלחמות היהודים ספר ד' ח' 1).
מכאן ואילך הייתה לוד עיר מקלט לחכמים שברחו מפני אימת המלכות. כאן מצאו החכמים מקלט בטוח, כנראה מפני שאספסיאנוס ברית עם יושבי לוד ויבנה, במסע כיבושיו בדרכו לירושלים, והוא הושיב בהן יהודים אשר נכנעו לו או מצאו חן בעיניו. וזאת גם הסיבה שר' יוחנן בן זכאי ביקש להציל דווקא שתי ערים אלו, שבהן התיישבו חכמים רבים שהשלימו כבר עם שלטון רומי, כי ראו שאין תקווה לניצחון על רומי האדירה, והעדיפו ללמוד תורה בשקט ובשלווה. מתוך: וקרט, אורה, 1977, לוד - גיאוגראפיה היסטורית, הוצאת גומא ועיריית לוד - צ'ריקובר.
כך התרכזו בלוד חכמים רבים אשר היו מניצולי ירושלים. חכמים אלה עם יהודים רבים אחרים אשר התיישבו בה לאחר חורבן ירושלים הפכו את לוד למרכז יהודי חשוב , עד כי זכתה העיר וכונתה בשם "המשנה לירושלים". מתוך: זוהר ברעם, מאמעוס ועד לוד שפלה מלוד ועד הים עמק.

גם בתקופה מאוחרת יותר ראו אנשים שברחו מפני אימת המלכות את לוד כעיר מקלט. מסופר ש "עולא בן קושב נתבע למלכות. ברח והלך לו ללוד אצל ר' יהושע בן לוי. באו (חיילי רומי, שדרשו את הסגרת המורד) והקיפו את המדינה (לוד), ואמרו להם "אם אין אתם מוסרים אותו לנו - אנו מחריבים את המדינה". נטפל לו ר' יהושע בן לוי ופייסו ואמרו לו: "מוטב שייהרג אותו האיש (עולא) ולא ייהרג הציבור על ידו". נתפייס לו ומסרו להם. מתוך: וקרט, אורה, 1977, לוד - גיאוגראפיה היסטורית, הוצאת גומא ועיריית לוד - צ'ריקובר.
התקופה שבין חורבן הבית (70 לספירה) לבין מרד גאלוס (שנת 351 לספירה), מתאפיינת על ידי תהליך של עיור הולך וגובר בארץ יהודה. לוד נהנתה מתהליך זה ואוכלוסייתה הלכה והתעצמה במשך כל התקופה. אולם, אוכלוסיית העיר אינה נשארת יהודית ביסודה לאורך כל התקופה. תחילה רוב האוכלוסיה היה יהודי ומיעוטה נוכרי אך במהלך השנים השתנה היחס והיהודים הפכו להיות מיעוט.
בימי שלטון הקיסר הרומי ספטימוס סוורס בשנת 200 לספירה קיבלה לוד מעמד של עיר רומית ושמה דיוספוליס. שם זה טבוע על מטבעות לוד מהתקופה הסוורית. מתוך: זוהר ברעם, מאמעוס ועד לוד שפלה מלוד ועד הים עמק.